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三磷酸腺苷的發酵生產工藝流程及操作步驟-核酸類藥物發酵技術

、三磷酸腺苷的概述

1.三舜酸腺并的結構

三磷酸腺苷（ATP）是由1個腺嘌呤、1個核糖和3個磷酸單位組成的核苷酸，結構式如下：H，N O OHOH

2.三磷酸踩苷的理化性質

藥用ATP是其二鈉鹽（ATP-Na?），又名腺苷三磷酸二鈉，帶3個結晶水（ATP-Na；·3H:O），呈白色結晶形及類白色粉末；無臭，微有酸味，有吸濕性；易溶于水，難溶于乙醇、、苯、，在堿性溶液（pH10）中較穩定。ATP-Na?為兩性化合物。

3.三磷酸腺并的生理功能

三磷酸腺苷是體內組織細胞切生命活動所需能量的直接來源，被譽為細胞內能的“分子貨幣"，儲存和傳遞化學能，蛋白質、脂肪、糖和核苷酸的合成都需要它參與，可促使機體各種細胞的修復和再生，增強細胞代謝活性，對治療各種疾病均有較強的針對性。

二、三磷酸腺苷的生產方法

ATP是重要的醫藥品，其生產方法可以腺嘌呤為前體用發酵法直接生產，也可以AMP為原料，經過磷酸化作用生成ATP。AMP可以腺嘌呤為前體發酵生產，也可先發酵生產腺苷，再經微生物磷酸化或化學方法磷酸化而創得。

1.AMP的生產

1）以腺嘌呤為前體發酵生產AMP產氨短桿菌ATCC6872等菌株可由嘌呤堿基生成相應的嘌呤核苷酸。例如由腺票呤生成AMP、ADP和ATP.在該發酵過程中，產氨短桿菌補效途徑活性強和磷酸酯酶活性弱的特點有利于核苷酸的生成和積累。

2）以腺嘌呤為前體發酵生產腺苷

1962年，Nara等把枯草芽孢桿茵160（Sm2+try）菌株經再次誘變得到的嘌呤缺陷型（Sm'+try+pur）菌株，在添加由丙二胺化學合成的腺嘌呤的培養基中培養，從而累積大量的脹苷。培養基的碳源以葡萄糖為佳，若添加少量核糖可增加腺苷的產量。氮源以蛋白胨、肉膏、酪朊氨基酸為佳。添加能提高腺甘產量，培養基中添加1~2

mg/ml的腺嘌呤，培養40h，可積累1mg/mL腺苷。

3）直接發酵生產腺苷

生產原苷的出發菌株般選用具有強烈的降解核苷酸酶系的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌。理想菌種的特性如下：

①喪失IMP脫氛酶，即缺陷型。為了防止回復突變，將其進步再誘變成喪失XMP的氯化酶，即增加缺陷型的遺傳標記是有效的。

②需要切斷從AMP到IMP的通路，喪失AMP脫氨酶或該酶活性微弱。

③為了積累腺苷，凡屬腺苷分解酶的核苷酶或核苷磷酸化酶的活性必須微弱。

④必須解除AMP類物質終產物反饋調節。可選育抗代謝類似物突變株，如8AG、8AX等，綜上所述，枯草芽孢桿菌作為腺苷產生菌的遺傳標記應具備：Xan+Gu+dea +8AG+Np。

2.微生物磷酸化

通過磷酸化作用可將、腺苷、鳥甘等核苷分別轉變成IMP、AMP、GMP等，并將AMP轉變為ADP、ATP，將GMP轉變為GDP、GTP。

面包酵母和清酒酵母的酶制劑可使AMP磷酸化為ADP和ATP，并伴隨有葡萄糖的降解。

使用磨碎的面包酵母或丙砌干燥的面包酵母菌體，在葡萄糖發酵條件下添加AMP或腺苷，進行氧化磷酸化。所加入的AMP或腺苷被高效地磷酸化為ATP和ADP。反應3h，可將約72%的AMP磷酸化為ATP。作為酶原，若使用風于菌體或活菌體，AMP的磷酸化幾乎不能進行。自腺苷磷酸化生成ATP，只能使用丙酮干燥菌體。該方法的關鍵在于反應液中磷酸鹽緩沖液的濃度。即在使用丙酮干燥菌體的場合下，磷酸鹽緩沖液濃度為1/3mol/L時才能引起AMP的磷酸化；當磷酸鹽緩沖液的濃度為1/9mol/L或2/3mol/L時，磷酸化反應不能發生。使用研碎菌體時，磷酸化的適磷酸鹽沖液濃度為1/4mol/L。關于ATP的生成機制，可以認為是利用葡萄糖分解時獲得的能量，通過底物水平磷酸化，由AMP或腺苷經ADP生成ATP。就發酵條件而言，以高濃度Pi抑制磷酸酯酶的作用和用AMP解除高磷酸鹽濃度時的發酵障得是此方法的本質。

3.發酵法生產ATP

根據以腺嘌呤為前體發酵生產AMP的初步研究結果，進步改良發酵工藝，則有可能大生產ATP。

產氨短桿菌B1-787經菌種培養后移入發酵罐培養，在適當的培養基、溫度、pH、通氣及攪拌條件下培養40h，后加入前體物質腺嘌呤及表面活性劑和尿素，控制條件繼續培養，使發酵結束時發醉液中含有較多的ATP。

發酵液經適當的預處理，過濾得到濾液，經活性炭柱吸附和氨醇溶液洗脫，獲得ATP溶液。ATP的磷酸基在堿性氨醇中解離成陰離子，經陰離子交換柱吸附，用定離子強度的溶劑洗脫，收集得到ATP粗品，用結晶法獲得ATP精品。

上述發酵方法以采用高濃度磷酸鹽為特征，添加表面活性劑可以提高ATP產量。

此外，加入氨基酸、維生素等可促進營養缺陷型生產菌株的生長，防止發酵過程中回復突變的發生，有利于穩定發醉，提高ATP產量。

三、菌種培養

培養基成分：葡萄糖10%，MgSO，·7H?01%，尿素0.3%，CaCl?·2H2O0.01%，玉米漿適量，1%，磷酸二氫鉀1%，pH為7.2.

各種子培養時間為0~24h，接種量為7%~9%，pH控制在6.8~7.2。

四、發酵培養

將菌種接種到發酵罐培養28~30℃，24h前通氣量為0.5：1，24h后通氣量為1.0：1，40h后投入腺嘌呤0.2%，6501（椰子油酰胺）0.15%，尿素0.3%，升溫至37C，pH為7.0.

五、提取及精制

發酵液加熱使酶失活后，調節pH至3~3.5；過濾除去菌體，濾液通過769型活性炭柱，用氨醇溶液洗脫，洗脫液再經Cl-型陰離子柱，經氯化鈉-鹽酸溶液洗脫，洗脫液用結晶法制得ATP精品。

考思考題

1.核酸類藥物主要有哪些臨床應用？舉例說明。

2.有何性質？目前發酵法生產主要有哪幾種途徑？

3.簡述發酵生產的過程。

4.ATP的結構與性質是怎樣的？

5.簡述ATP發酵生產的過程。