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任務(wù)3糖化酶的分離提取及性質(zhì)分析

、糖化酶的分離提取

成品糖化酶可分為液體酶和固體酶兩種，固體酶的制備方法可分為鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法和吸附法等，采用條合理的提取工藝，可制備系列酶產(chǎn)品以滿足不同行業(yè)的需求及降低成品的成本，具體流程如圖6-13所示。

發(fā)稱被硫續(xù)沉淀1論游液回收i粉停穩(wěn)定劑、防腐劑滋件烘干包裝包裝數(shù)食品）烘干、粘碎揚(yáng)碎《食品哦工業(yè)）包裝（食品》包裝（工業(yè)）

圖6-13糖化酶固體確提取制備工藝流程

目前內(nèi)對(duì)液體酶產(chǎn)品采用的濃縮方法有兩種，種為依靠熱源來蒸發(fā)產(chǎn)品中的水分，另種為利用滲透膜超濾除去產(chǎn)品中的水分。比較上述兩種方法，前者設(shè)備投資大、耗能多；而后者投資少、耗能低，且操作簡(jiǎn)單、清洗方便、維修及更換成本低，產(chǎn)品收率高。

滲透膜超濾濃縮方法中，絮凝工藝是提取工藝中關(guān)鍵的步，直接決定板框過濾等工序的工作與產(chǎn)品的質(zhì)量，滲透膜超濾濃縮法流程如圖6-14所示。

發(fā)辭液—絮—板框壓鍵—鍵液蛇餅超密濃絡(luò)干燥后作填充劑我飼料防版和標(biāo)準(zhǔn)化處理成品

圖6-14滲透膜超灣濃縮制備液體糖化硫工藝流

根根據(jù)上述過程可知，糖化酶的分離提取主要有以下幾個(gè)步驟。

1.酶液的獲得與預(yù)處理

固態(tài)培養(yǎng)：取孢子布滿麩曲、酶活力已達(dá)高峰的固態(tài)基質(zhì)，用0.9%的生理鹽水?dāng)嚢杞?h，4層紗布過濾，濾液于4℃，6000r/min，離心10min，上清液即為粗酶液。

液態(tài)培養(yǎng)：直接取發(fā)酵液于4C下離心、洗滌，上清液經(jīng)紗布過濾，合并后得到粗醉液。

預(yù)處理：由于發(fā)酵所采用的培養(yǎng)基大多含有麩皮等纖維成分，經(jīng)初步分離所得的粗酶液中大多含有大量不溶性雜質(zhì)，因此還需要經(jīng)過絮凝和壓濾的處理，從而大大改善發(fā)酵液的過濾性，提高澄清度。應(yīng)用作為糖化酶絮凝劑的種類主要有APAM（陰離子案丙烯酰胺）、、硅藻土、硫酸鋅、黃血鹽等，具體加入種類和濃度須經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定。精制濃縮液體糖化酶的生產(chǎn)過程中，絮凝工藝是關(guān)鍵的步，如果絮凝效果不好，將導(dǎo)致處理時(shí)間長(zhǎng)，增加染菌的可能性。

2.碎液的濃縮

經(jīng)過預(yù)處理的粗酶液般糖化酶的濃度較低，不適合工業(yè)化需要，需要進(jìn)步地濃縮。其方法可采用真空濃縮、酒精沉淀、超濾等。前兩種方法多用于固體酶制劑的制備，超濾多用于液體制劑的制備。

超濾是加壓膜過濾方法的種，其工作原理是在定壓力下把大溶質(zhì)分子阻留在藤的側(cè)（留在原來的溶液中），而小溶質(zhì)分子透過至膜的另側(cè)，從而達(dá)到分離純化、濃縮產(chǎn)物的目的。超濾法適用于牛物大分子發(fā)酵產(chǎn)品（如糖化酶、a-）等的提取純化和濃縮。該工藝具有成本低、操作方便、條件溫和、較好地保持酶活力、產(chǎn)品回收率高等該方法的使用過程中，需要根據(jù)產(chǎn)品質(zhì)量和工藝要求選擇超濾膜、進(jìn)料口壓力、出料口壓力、進(jìn)出料口之壓差、操作溫度（不超過40℃）、濃縮倍數(shù)等條件，以達(dá)到佳的效果。

運(yùn)行過程中定時(shí)測(cè)定超濾液的流及酶活力，以確認(rèn)超濾器運(yùn)行是否正常。

同時(shí)，李靜等（2010）用雙水相體系[PEG/KH，PO.、PEG/（NH。）：S0，和PEG/

MgSQ.]萃取糖化酶，其中以PEG/（NH。）：SO.雙水相體系在PEG相對(duì)分子質(zhì)量為20000、PEG溶液濃度為28%、（NH。）：SO，溶液濃度為20%時(shí)，分配系數(shù)為0.15，萃取效果好，即糖化酶回收率高（96.1%）。

3.酶液的千燥與后處理

如果制作固體酶制劑，將獲得的濃縮液沉淀、離心后，所得酶泥放入干燥箱中40℃熱風(fēng)干燥，干燥物磨粉后加入防腐劑、穩(wěn)定劑（如、、醋酸鈣等）即得到租酶制劑成品。

而液體醉制劑，只需在濃縮液中加入防腐劑、穩(wěn)定劑即可。

二、糖化酶的性質(zhì)分析

1.糖化酶活力測(cè)定

具體參考本書相關(guān)內(nèi)容。

2.糖化酶性質(zhì)

籍化酶相對(duì)分子質(zhì)量：瓣化酶是種組合酶，采用離子交換層析法分離純化其各種成分（測(cè)定有活性的），收集后，經(jīng)電泳得到其相對(duì)分子質(zhì)量。

適反應(yīng)溫度：將適量經(jīng)層析純化的醇制劑溶于定pH的緩沖液中，在不同溫度下分別測(cè)定糖化酶活力，以高酶活力為，繪出反應(yīng)溫度與酶活力的相關(guān)曲線。熱穩(wěn)定性：將適量經(jīng)層析純化的酶制劑溶于定pH的緩沖液中，在不同溫度下分別保溫不同時(shí)間后，測(cè)定糖化酶活力，以不經(jīng)保溫的酶活力為，繪出保溫時(shí)間與酶活力的相關(guān)曲線。

適pH：將適量經(jīng)層析純化的制劑溶于不同pH的緩沖液中，在適溫度下分別測(cè)定糖化酶活力，以高酶活力為，繪出不同pH與酶活力的相關(guān)曲線。

思考題

1.糖化酶的特點(diǎn)有哪些？

2.薪化酶產(chǎn)生菌分離篩選的主要方法流程是怎樣的？

3.糖化醇的實(shí)際應(yīng)用有哪些方面？

4.糖化酶的作用特點(diǎn)與纖維素酶有何異同？

5.產(chǎn)糖化酶真菌與產(chǎn)纖維素酶真菌的培養(yǎng)特點(diǎn)有何異同？