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實驗室階段種子制備流程
閱讀：730 發布時間：2022-11-17實驗室階段種子制備流程
在發酵生產中，各個生產環節環環相扣，任何個環節達不到生產工藝的要求，都會造成不可逆轉的巨大損失，而種子擴大培養又當其沖，因此必須高度重視種子擴大培養這環節。不同種子的擴大培養工藝流程總體相似，但是具體的控制條件（如溫度、培養時間等）都因種子不同而有些差別，這些差別往往是種子擴大培養成功與否的關鍵。因此，在擴大培養特定的種子時，在遵循種子擴大培養的般原則和般流程的基礎上，應根據種子特性和生產要求做適當調整，也可以進行試驗，優化種子擴大培養工藝。
細菌、酵母菌、霉菌和放線菌的生理特性顯著不同，種子擴大培養工藝流程差別也較大。實驗室種子的制備般采用兩種方式：①對于產泡子能力強及孢子發芽、生長繁殖快的種子（如霉菌等），可以采用固體培養基培養孢子，孢子直接作為種子罐的種子。這種方法操作簡便，不易污染雜菌。②對于細菌、酵母菌或產孢子能力不強、孢子發芽慢的種子（如鏈霉菌），采用液體搖瓶培養。
（1）細菌實驗室擴大培養
原種般保存在冷凍管內，些產芽孢的細菌（如芽孢桿菌等）可用斜面或沙土管保存。其擴大培養工藝為（包括生產車間種子制備）：冷凍管或斜面斜面斜面（二代以上）種子罐發酵罐細菌培養的適溫度般為37℃（近年來對海洋微生物的研究表明，有許多菌株為低溫菌株，適生長溫度在15℃左右），培養時間因菌種而異，達到對數生長期般要20h左右，有的芽孢需5~6d，甚至20d以上。
細菌種子的培養基般采用碳氮比較小的培養基，氮源供應要相對豐富些。如牛肉膏、蛋白胨、酵母育、馬丁肉湯等，因為有充足的氮源供應，可以大限度地復蘇菌種活力或使菌體的增殖速率達到大。
制備細菌斜面時，先在冷凍管加入適量無菌水（加入無菌水使菌體均勻分布在水中，便于轉接；同時保證同支菌種轉接的不同斜面相對較均），制成懸浮液，用以接斜面，并控制好斜面的涂布面積，使菌落分布均勻，密度適宜。劃線后的接種針應做雙碟劃線培養或浸入肉湯做無菌檢驗。
（2）放線菌實驗室階段擴大培養
孢子制備是發酵生產的起始環節，孢子的質量、數量對后續工藝中的菌絲的生長、繁殖和發酵水平都有明顯的影響。菌種不同，孢子的制備工藝不同。放線菌的孢子培養基多采用半合成培養基，培養基中含有適合孢子形成的營養成分，如麩皮、蛋白胨和無機鹽。培養基中氮源不能太豐富，碳氮比應該大些，從而避免菌絲的大量形成，以產生大量孢子。其擴大培養工藝如下（包括生產車間種子擴大培養工藝）：冷凍管或沙士管斜面代斜面二代搖瓶種子罐發酵罐放線菌孢子的培養溫度多為28℃，部分菌種為30℃或37℃，培養時間因菌種不同而異，般為4~7d，也有14d，甚至有些達到21d。孢子成熟后于5℃保存。存放時間不宜過長，般在周內，少數品種可存放30~90d。
制備放線菌孢子時，先要制備合格的瓊脂斜面。瓊脂斜面培養基滅菌后，冷卻到40℃左右放置，溫度不宜過高，否則冷凝水較多。待斜面凝固后恒溫培養7~8d，經檢查無雜菌后于4~6℃冰箱內保存備用，放置時間以不超過30d為宜。使用前在27~30C恒溫箱中培養1d。操作時用滅菌冷卻后的接種勺直接從沙土管內取適量沙土孢子（必須使用干接種法），然后均勻地散布在斜面培養基上，使長出的菌落密度分布均勻。沙土管用后可以立即冷藏保存備用，但是為杜絕雜菌污染，般應考慮廢棄。
進行斜面傳代，好不要超過三代，以防衰老和變異，必要時對斜面進行觀察。斜面孢子移植時，好采用點種法。挑選形態正常的單個菌落，用接種針將孢子輕輕沾下，用劃線法在斜面上劃線，在斜面中下段形成單菌落，便于挑選傳代的菌種。懸浮液接種要控制濃度，菌落不宜過密或過稀，過密容易把低單位或不正常的菌落掩蓋，檢查時難以發現；過稀則孢子數量太少，不宜用作種子。劃線后的接種針均需浸入肉湯做無菌檢查，培養2d觀察是否污染雜菌。
（3）酵母菌實驗室階段擴大培養
酵母菌的種子擴大培養工藝（包括生產車間階段）如下所示，般采用麥汁培養基進行擴大培養：試管斜面富氏瓶巴氏瓶卡氏罐漢生罐增殖罐發酵罐在有些工業化生產中，菌種生產廠把酵母菌制備為能長時間保存的固體菌種。生產廠把固體菌種以較大接種量接種于卡氏罐中，然后逐擴大培養。這樣可以使菌種生產廠和產品生產廠各自充分發揮自身優勢，提高產品質量，降低設備投入和生產成本等。有些廠甚至直接把大量的固體菌種在經增殖罐活化增殖后接入發酵罐，這樣做可以減少工藝步驟，避免污染。
（4）霉菌擴大培養工藝
毒菌孢子培養大多采用大米、小米、麥麩等來源豐富、簡單易得、價格低廉的天然培養基。天然培養基營養豐富，般比合成培養基產生孢子的數量多（不同來源的天然培養基，其成分可能相差較大，有時會對菌種擴大培養產生不利影響）。菌種擴大培養工藝（包括生產車間擴大培養工藝）為：沙士管或冷凍管或斜面母斜面子斜面搖瓶種子罐發酵罐先將保存的孢子接種在斜面進行培養，待孢子成熟后制孢子懸浮液，接種到大米或小米等培養基上，培養成熟成為“親米"
由“親米"再轉到大米或小米培養基上，培養成熟成為“生產米"“生產米"接入種子罐。“親米"和“生產米"的培養溫度般為26~28℃，培養時間因菌種不同而異，般為4~14d。為了使通氣均勻，菌體分散度大，局部營養供應均，在培養過程中要注意翻動或攪動培養基。制備好的大米或小米孢子，可放在5℃冰箱內保存備用，或將大米或小米孢子的水分去除到含水量在1%以下后保存備用。這種干燥孢子可在生產上連續使用180d左右。干燥孢子可以保存的時間較長，但是在整個孢子制備過程中要嚴格控制無雜菌污染，同時保存孢子的環境和設備要保證無雜菌污染的可能性。
制備孢子時要使母斜面生長的菌落盡可能分散，以便挑選理想的單個菌落。接種時應選取豐滿的孢子，不要觸及菌落邊緣的菌絲。吸懸浮液時注意吸管上端塞的棉花要緊些，吸管下口要大些，吸管頭不能接觸火焰，否則孢子容易燙死或溢出口外，使用后的吸管隨即插入肉湯內浸下做無菌檢查。吸取孢子懸浮液體，也可以用移液槍（槍頭先滅菌）在無菌環境下直接吸取，該方法方便、快捷。如果用帶有過濾膜的移液槍，可以非常好地做到無雜菌污染。
孢子進罐的方式分為兩種：直接進罐和經過搖瓶擴大培養后間接進罐。直接進罐的優點有：工藝路線較短，容易控制；斜面孢子易于保藏，菌種純度高，次操作制備的孢子量較大。因此，直接進罐可節約人力、物力和時間，并減少染菌機會，為穩定生產提供有利條件。某些微生物菌種的孢子發芽和菌絲繁殖速度較緩慢，為了縮短種子培養周期和穩定種子質量，將孢子經搖瓶培養成菌絲后再進罐。搖瓶的培養基配方和培養條件與種子罐近似。制備搖瓶種子的目的是使孢子發芽長成茁壯的菌絲，從而增加菌體的活力和菌體數量，同時可以先對斜面孢子的質量和無菌情況進行考察，然后選擇質量較好的作為菌種保留。搖瓶種子進罐常用兩培養的方式：母瓶培養和子瓶培養。母瓶培養基成分比較豐富，易于分解利用，氨源豐富利于菌絲生長。子瓶培養基更接近于種子罐的培養基組成。搖瓶種子進罐的缺點是工藝過程長，操作過程中染菌幾率高。搖瓶種子的質量主要以外觀顏色、菌絲濃度或黏度、效價以及糖氮代謝、ph值為指標，符合要求后方可進罐。